ניתוח נתונים ציבוריים
נתונים על שושלות SARS-CoV-2 והתאריך שבו הדגימה נלקחה מהרצפים הזמינים מצ'ילה התקבלו מאתר Consorcio Genomas CoV2 הזמין בכתובת https://auspice.cov2.cl/ncov/chile-global. נתוני החיסונים התקבלו מנתונים ציבוריים ממשרד המדע, הטכנולוגיה, הידע והחדשנות הזמינים בכתובת https://github.com/MinCiencia/Datos-COVID19 (מוצר 83).
מבחן זיהומיות
וירוסים פסאודוטיפוסים הנושאים חלבוני ספייק שונים של SARS-CoV-2 הוכנו כפי שתיארנו בעבר12. בקצרה, פסאודוטייפים SARS-CoV-1 מבוססי HIV-2 הופקו בתאי HEK293T על ידי טרנספקציה של ה-pNL4.3-ΔEnv-Luc יחד עם וקטור קידוד pCDNA-SARS-CoV-2 Spike המתאים ביחס מולרי של 1:1. פלסמידים המקודדים ספייק מותאם לקודון חסרים את 19 חומצות האמינו האחרונות של הקצה ה-C-טרמינלי (SΔ19) הידועים כממנעים החזקה ברשת האנדופלזמית12 הושגו על ידי סינתזת גנים או מוטגנזה מותאמת לאתר (GeneScript) והכילו את המוטציות הבאות: שושלת A (רצף התייחסות), שושלת B (D614G), שושלת B.1.1.7 (Δ69-70, Δ144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H), שושלת P.1 (L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027I, T37I, T75I,C. 76- 246, L252Q, F452S, D490G, T614N). כל תכשיר פסאודוטיפוס נוקה על ידי צנטריפוגה ב-859 סל"ד בטמפרטורת החדר, הוכמת באמצעות ערכת ה-HIV-3,000 Gag p1 Quantikine ELISA (R&D Systems), מנותחת בסרום בקר עוברי של 24% (Sigma-Aldrich) ואוחסנה ב-50 מעלות צלזיוס עד להשתמש. נעשה שימוש בכמויות שונות של וירוסים פסבדוטייפ (כפי שנקבע על ידי רמות החלבון HIV-80 p1) כדי להדביק תאי HEK-ACE24 ו-2 שעות לאחר מכן, פעילות לוציפראז של גחליליות נמדדה באמצעות ריאגנט Luciferase Assay (Promega) ב-Glomax 48 Microplate luminometer (פרומגה).
Assay נטרול
מבחני נטרול וירוסים פסאודוטיפוסים בוצעו בעיקרם כפי שתיארנו קודם לכן12. בקצרה, דילולים סדרתיים של דגימות הפלזמה (1:4 עד 1:8748) הוכנו ב-DMEM עם 10% סרום בקר עוברי והודגרו עם 5 ננוגרם של p24 של כל וירוס פסאודוטייפ במהלך שעה אחת ב-1 מעלות צלזיוס ולאחר מכן, 37×1.4 של תאי HEK-ACE2 נוספו לכל באר. תאי HEK293T (לא מבטאים ACE2) שהודגרו עם הנגיף הפסאודוטיפוס (שושלת A) שימשו כביקורת שלילית. תאים עברו lysed 48 שעות לאחר מכן, ופעילות luciferase של גחליליות נמדדה באמצעות ריאגנט Luciferase Assay (Promega) ב-Glomax 96 Microplate luminometer (Promega). אחוז הנטרול עבור כל דילול חושב וה-ID50 של כל דגימה חושב באמצעות GraphPad Prism גרסה 9.0.1.
ניתוח סטטיסטי
ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת GraphPad Prism גרסה 9.1.2. השוואות קבוצות מרובות לנטרול טיטר נוגדנים (NAbTs) מול פאנל של וירוסים פסאודוטיפיים של SARS-CoV-2, כמו גם השוואות של תגובות NAbs לפי מין ועשן בוצעו באמצעות בדיקת Wilcoxon בדירוג חתום. שינוי הפקטור חושב כהפרש של כיטר ממוצע גיאומטרי במזהה50 בהשוואה לזה של הווירוס הפסאודוטיפוס מסוג Wild. ניתוח מתאם בין NAbTs לגיל או BMI בוצע באמצעות מבחן Spearman. בדיקת ANOVA חד כיוונית ובדיקת ההשוואה המרובה של Tukey בוצעו לצורך ניתוח סטטיסטי של זיהום. ערך p ≤0.05 נחשב כמובהק סטטיסטית.
אישור מוסרי
פרוטוקול המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה ב-Universidad de Chile (פרויקטים מס' 0361-2021 ו-N°096-2020) ו-Clínica Santa Maria (פרויקט מס' 132604-21). כל התורמים חתמו על הסכמה מדעת, והדגימות שלהם היו אנונימיות.
השפעת מוטציות הספייק בגרסת למבדה על זיהומיות ונטרול תגובות נוגדנים
ניתוח של 3695 רצפים מצ'ילה שהופקדו ב-GISAID ב-24 ביוניth 2021 מראה דומיננטיות ברורה של גרסאות ה-SARS-CoV-2 Gamma ולמבדה במהלך השליש האחרון, יחד, עבור 79% מכל הרצפים.
מעניין לציין שהתקופה הזו אופיינה במסע חיסונים מאסיבי בו 65.6% מאוכלוסיית היעד (בני 18 ומעלה) קיבלו תכנית חיסונים מלאה נכון ל-27 ביוני.th 2021
בהתחשב בעובדה ש-78.2% מהאנשים שחוסנו עם תכנית מלאה קיבלו את חיסון הנגיף המומת CoronaVac מבית Sinovac Biotech, ביקשנו לחקור את ההשפעה של מוטציות הספייק הקיימות בווריאציה של Lambda על יכולת הנטרול של נוגדנים שנוצרו על ידי חיסון זה.
לשם כך, יצרנו וירוסים פסאודוטיפיים מבוססי HIV-1 SARS-CoV-2 הנושאים את חלבון הספייק משושלת הייחוס של Wuhan-1 (סוג פראי; שושלת A), המוטציה D614G (שושלת B), והאלפא (שושלת B) .1.1.7), גרסאות גמא (שושלת P.1) ולמבדה (שושלת C.37).
במהלך הכנת הנגיף, ראינו באופן עקבי שתאים שנדבקו בנגיף הפסבדוטייפ הנושאים את ספייק ה-Lambda יצרו ערכי ביולוגיות גבוהים משמעותית בהשוואה למוטנט D614G או לגרסאות אלפא וגמא, המצביעים על מוגברת הדבקות המונעת על ידי חלבון ספייק ה- Lambda.
האיור 1.זיהומיות המתווכת על ידי חלבוני ספייק שונים.
(א) ייצוג סכמטי של חלבון הספייק SARS-CoV-2 והווריאציות ששימשו במחקר זה. שושלות מסומנות בסוגריים. RBD, תחום מחייב קולטן, CM; זנב ציטופלזמי.
(ב) טיטרציה של הפסאודוטיפים של כל שושלת באמצעות כמויות שוות של HIV-1 p24. פעילות הלוציפראז של גחליליות נמדדה כיחידות זוהר יחסי (RLU) ב-48 שעות לאחר ההדבקה. הממוצע וה-SD חושבו מניסוי מייצג משולש.
לאחר מכן, השתמשנו בווירוסים הפסבדוטייפ שהוזכרו לעיל כדי לבצע מבחני נטרול באמצעות 79 דגימות פלזמה מעובדי בריאות בריאים מאוניברסידד דה צ'ילה ומקליניקה סנטה מריה בסנטיאגו, צ'ילה.
לא כללנו 4 דגימות מכיוון שלא הצלחנו לחשב טיטר ID50. מהדגימות המנותחות, 73% תאמו לנשים, גיל חציוני 34 שנים (IQR 29 - 43) ואינדקס גוף מרבי (BMI) של 25 (IQR 22.7 - 27). 20.5% מהמשתתפים הצהירו שהם מעשנים פעילים במהלך תקופת החיסון. דגימות התקבלו בחציון של 95 ימים (IQR 76 - 96) לאחר המנה השנייה של החיסון CoronaVac
ראינו שניטרול הנגיף הפסבדוטייפ הנושא את חלבון ספייק מסוג Wild הביא לדילול מעכב של 50% (ID50) טיטר ממוצע של 191.46 (154.9 - 227.95, 95% CI,), בעוד שזה היה 153.92 (115.68 - 192.16, 95% CI), 124.73 (86.2 - 163.2, 95% CI), 104.57 (75.02 - 134.11, 95% CI), 78.75 (49.8 - 107.6, 95% CI), 614 (XNUMX - XNUMX, XNUMX% CI)) (XNUMX - XNUMX, XNUMX%)))))))) ) ו-XNUMX (XNUMX - XNUMX, XNUMX% CI) עבור וירוסים פסאודוטיפוסים הנושאים את חלבון הספייק מהמוטנט DXNUMXG או גרסאות אלפא, גמא ולמבדה, בהתאמה.
ראינו גם שהטיטר הממוצע הגיאומטרי של המזהה50 טיטרים ירדו בפקטור של 3.05 (2.57 - 3.61, 95% CI) עבור הנגיף הפסבדוטייפ הנושא את ספייק ה-Lambda, 2.33 (1.95 - 2.80, 95% CI) עבור ספייק גמא, 2.03 (1.71 - 2.41% CI, 95) עבור ספייק אלפא ו-1.37 (1.20 - 1.55, 95% CI) עבור ספייק D614G בהשוואה לספייק מסוג Wild.
לא נצפה מתאם בין מין, גיל, אינדקס מסת גוף (BMI) או מצב עשן וטיטר נוגדנים מנטרלים בקבוצת המחקר שלנו.
האיור 2.בדיקת נטרול באמצעות דגימות פלזמה מחוסני CoronaVac
(א) שינויים בטיטר הנטרול ההדדי של 50% (מזהה50) בדגימות פלזמה מ-75 מקבלי חיסון CoronaVac נגד D614G (שושלת B), אלפא (שושלת B.1.1.7),
גרסאות גמא (שושלת P.1) ולמבדה (שושלת C.37) בהשוואה לנגיף מסוג פראי. התוצאות מוצגות כהבדל בטיטרי הנטרול של דגימות מותאמות. ערכי P להשוואת המזהה50 מחושבים עם מבחן דרגה חתומה של Wilcoxon.
(ב) חלקות תיבה ציינו את הטווח החציוני והבין-רבעוני (IQR) של ID50 עבור כל וירוס פסאודוטיפוס. שינויים בגורמים מוצגים כהבדל של כיטר ממוצע גיאומטרי במזהה50 בהשוואה לאלה של הווירוס הפסאודוטיפוס מסוג Wild. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות מבחן Wilcoxon matched-pars signed-rank.
יחד, הנתונים שלנו חשפו שחלבון הספייק של הווריאציה החדשה של עניין Lambda, המופץ מאוד במדינות צ'ילה ודרום אמריקה, נושא מוטציות המעניקות זיהומיות מוגברת ויכולת לברוח מנוגדנים מנטרלים שנוצרו על ידי CoronaVac.
